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RNA適配體熒光探針介紹：
發(fā)光 RNA 適體或熒光發(fā)光適體 (FLAP) 是一種基因編碼的 RNA 成像平臺(tái)。 它們旨在結(jié)合特定的熒光染料，這些染料僅在結(jié)合狀態(tài)下“發(fā)光”。 這種“熒光性”的特性意味著熒光可以在 RNA 表達(dá)時(shí)“開(kāi)啟”。 發(fā)光適體可以被認(rèn)為是熒光蛋白（如 GFP）的 RNA 對(duì)應(yīng)物。 常用的發(fā)光適體包括菠菜、芒果、玉米和西蘭花，以其鮮艷的色彩命名。

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RAN適配體熒光探針產(chǎn)品：

產(chǎn)品	貨號(hào)	應(yīng)用
DFHBI	YZM018895	GFP fluorophore mimic for imaging RNA in living cells
DFHBI-1T	FMK14465	GFP fluorophore mimic for imaging RNA in living cells
DFHO	FMK14466	RFP fluorophore mimic for imaging RNA in living cells

 

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點(diǎn)亮RNA適體,RNA成像
基于 RNA 的熒光復(fù)合物或模塊由兩部分組成，一個(gè)發(fā)光的 RNA 適體和一個(gè)熒光同源染料，即“熒光素”，它以高親和力結(jié)合發(fā)光的 RNA 適體。一旦結(jié)合，復(fù)合物就會(huì)變得高度熒光。發(fā)光的 RNA 適體和熒光素除非相互結(jié)合，否則不會(huì)發(fā)出熒光，這使得該系統(tǒng)對(duì) RNA 成像非常有效。

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點(diǎn)亮 RNA 適體的原理
通過(guò)用于重組 DNA 的常用技術(shù)，將點(diǎn)亮的 RNA 適體序列通過(guò)基因工程改造為感興趣的 RNA 序列。然后通過(guò)宿主細(xì)胞機(jī)制將其轉(zhuǎn)錄為 RNA。然后添加高親和力同源熒光素，它與 Light-up RNA 適體結(jié)合，并在適當(dāng)波長(zhǎng)的刺激下發(fā)出明亮的熒光。
熒光素在未結(jié)合狀態(tài)下是非熒光的；來(lái)自激發(fā)的能量通過(guò)分子振動(dòng)（例如熱）等非輻射途徑消散。當(dāng)熒光素與適體結(jié)合時(shí)，施加在熒光素上的構(gòu)象變化導(dǎo)致非輻射途徑的抑制，并且當(dāng)激發(fā)能量通過(guò)光子耗散時(shí)產(chǎn)生明亮的熒光。見(jiàn)下圖。
菠菜適體和熒光素 DFHBI 就是例子，它們是在 S. R Jaffrey 的實(shí)驗(yàn)室中發(fā)現(xiàn)的（參見(jiàn) Paige 等人，2011 年）。 4-羥基亞芐基咪唑啉酮 (HBI) 僅在與支架結(jié)合以形成穩(wěn)定分子的特定三級(jí)相互作用時(shí)才會(huì)產(chǎn)生熒光。當(dāng)存在稱(chēng)為菠菜適體的 98 個(gè)核苷酸長(zhǎng)的 RNA 時(shí)，HBI 的二氟衍生物 (DFHBI) 顯示出顯著增強(qiáng)的綠色熒光。 DFHBI 具有細(xì)胞滲透性，不會(huì)引起細(xì)胞毒性或光毒性。當(dāng)在活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中孵育時(shí)，可以通過(guò)熒光顯微鏡觀察到帶有菠菜適體標(biāo)簽的 5S rRNA 的運(yùn)輸。菠菜 2 適體和西蘭花適體隨后通過(guò)菠菜適體的系統(tǒng)誘變被開(kāi)發(fā)，以改善 RNA 適體的細(xì)胞內(nèi)折疊。

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Light-up RNA適體的技術(shù)優(yōu)勢(shì)
在 RNA 水平上研究轉(zhuǎn)錄和翻譯傳統(tǒng)上是使用熒光原位雜交 (FISH) 完成的，這需要對(duì)樣品進(jìn)行化學(xué)固定。 RNA 標(biāo)記系統(tǒng) MS2 是為活細(xì)胞中的 RNA 成像而開(kāi)發(fā)的。 該系統(tǒng)使用 MS2 莖環(huán) (MS2-SL) 對(duì) RNA 分子進(jìn)行遺傳標(biāo)記，該莖環(huán)與熒光蛋白 MS2 外殼蛋白 (MCP) 結(jié)合。 然而，該系統(tǒng)有幾個(gè)缺點(diǎn)，包括相對(duì)較大的 RNA 標(biāo)簽大小（對(duì) RNA 加工有負(fù)面影響），以及據(jù)稱(chēng)由于 MS2 陣列而阻斷了 5'-和 3'-核酸外切酶活性。 Mango II（發(fā)光適體）和 MS2-tdMCP-mCherry 雙標(biāo)記 mRNA 的直接比較表明，熒光 Mango 適體提供了更高的信噪比。 閱讀 Cawte 等人 (2020) 的更多信息。

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與 MS2 和 GFP 相比，Light-up RNA 適體系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢(shì)：
※產(chǎn)生異常高的熒光信噪比；
※ 非常明亮的熒光信號(hào)；
※ 發(fā)光適體是小 RNA 標(biāo)簽，因此干擾細(xì)胞功能的傾向較低；
※ 能夠在 RNA 水平上直接、快速地測(cè)量基因轉(zhuǎn)錄，從而更準(zhǔn)確地實(shí)時(shí)觀察 RNA 定位和啟動(dòng)子活性； GFP 在刺激后可能需要長(zhǎng)達(dá) 30 分鐘才能轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)。

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參考文獻(xiàn)：
※ Neubacher and Hennig (2019) RNA Structure and Cellular Applications of Fluorescent Light-Up Aptamers. Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 58 1266. PMID: 0102012
※ Swetha et al. (2020) Genetically encoded light-up RNA aptamers and their applications for imaging and biosensing. J.Mater.Chem.B. doi: 10.1039/c9tb02668a. [Epub ahead of print] PMID: 31984401

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