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熒光顯微鏡簡介：
熒光顯微鏡是光學(xué)顯微鏡的一種特殊形式。 它利用熒光染料被一定波長的光激發(fā)后發(fā)光的能力。 感興趣的蛋白質(zhì)可以通過抗體染色或用熒光蛋白標記用這種熒光染料進行標記。 它允許確定單個分子種類的分布、其數(shù)量及其在細胞內(nèi)的定位。 此外，可以進行共定位和相互作用研究，使用可逆結(jié)合染料觀察離子濃度，例如 觀察到 Ca2+ 和 fura-2，以及內(nèi)吞作用和胞吐作用等細胞過程。 今天，甚至可以借助熒光顯微鏡對亞分辨率粒子進行成像。

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斯托克斯頻移
熒光的一個重要特征是斯托克斯頻移。它描述了激發(fā)光子和發(fā)射光子的能級差異。熒光染料發(fā)射的光子比激發(fā)光子具有更大的波長。這是由于在熒光染料被激發(fā)之后但在其發(fā)射光子之前向周圍環(huán)境釋放能量。由此產(chǎn)生的波長偏移使得區(qū)分激發(fā)光和發(fā)射光成為可能。能量的吸收和發(fā)射可以看作是分子種類的特定特征。

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熒光顯微鏡
熒光顯微鏡（正置或倒置）類似于普通光學(xué)顯微鏡，不同之處在于照明由激光作為單色光或明亮且強大的光源（如汞蒸汽或氙弧燈）提供。此外，它還包含一個激發(fā)濾光片和一個發(fā)射濾光片。激發(fā)濾光片僅傳輸能夠用其特定染料激發(fā)樣品的光。樣品發(fā)出的光在到達檢測器之前必須通過發(fā)射濾光片。發(fā)射濾光片僅對具有不同波長的光是半透明的，例如樣品發(fā)出的光。

1. 熒光顯微鏡的光通路

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近年來，LED（發(fā)光二極管）也被用作熒光顯微鏡的光源。 LED 發(fā)出的光的波長取決于用于生產(chǎn)的材料。 然而，在大多數(shù)情況下都需要激發(fā)濾光片，因為 LED 通常會在相當寬的波長范圍內(nèi)發(fā)光。
大多數(shù)熒光顯微鏡是落射熒光顯微鏡。 照明器和物鏡位于樣品的同一側(cè)，光線不會穿過樣品。 除了激發(fā)和發(fā)射濾光片外，這種熒光顯微鏡還需要一個分色鏡。 分色鏡允許特定波長的光通過，而其他波長的光被反射。 濾光片和分色鏡通常一起插入濾光片立方體中。

2. 濾波器原理

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激發(fā)光通過激發(fā)濾光片并被引導(dǎo)至分色鏡。這會將通過物鏡的光反射到樣品上。樣品中的熒光染料被激發(fā)并發(fā)射光子。該發(fā)射光通過物鏡返回到分色鏡。發(fā)射的光具有適當?shù)牟ㄩL并且能夠通過。被試樣反射的激發(fā)光不能通過分色鏡，會被擋住。如果激發(fā)光能夠通過二向色鏡，它會在到達發(fā)射濾光片時被阻擋?？梢杂脵z測器測量通過發(fā)射濾光片的光。
熒光顯微鏡中使用了不同類型的濾光片?？梢詤^(qū)分帶通、長通和短通濾波器。帶通濾光片傳輸一個波長帶，而波長更大或更小的光將被阻擋。長通和短通濾波器是邊緣濾波器。長通濾光片傳輸長波長的光。波長高于某個截止值的光將無法通過。相反，短通濾光片傳輸短波長并阻擋長波長。

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不同的熒光顯微鏡中技術(shù)
熒光顯微鏡被廣泛使用并提供了很好的特異性。各種技術(shù)可以解決不同的問題，甚至可以繞過 Ernst Abbe 描述的衍射極限。
分子種類的定位可以通過細胞器的共染色來確定，例如細胞器。細胞骨架或細胞膜。共焦激光掃描顯微鏡 (CLSM) 可以在沒有來自焦平面外部的信號的情況下觀察樣本中的區(qū)域，并允許進行光學(xué)切片。全內(nèi)反射 (TIRF) 顯微鏡是一種允許觀察靠近細胞表面的薄區(qū)域的技術(shù)。漸逝場激發(fā)該區(qū)域的熒光染料。
一種觀察分子種類動力學(xué)的技術(shù)是光漂白后的熒光恢復(fù) (FRAP)。限制區(qū)域中的熒光染料被光漂白，并且可以測量未漂白分子擴散到該區(qū)域中的情況。可以使用熒光能量轉(zhuǎn)移 (FRET) 顯微鏡進行相互作用研究。激發(fā)的供體生色團可以將能量轉(zhuǎn)移到受體熒光染料并激發(fā)它。這只有在兩者非常緊密地結(jié)合在一起時才有可能。如果這些染料與不同的蛋白質(zhì)偶聯(lián)，它們只有在蛋白質(zhì)相互作用時才能傳遞能量并發(fā)出熒光。
允許亞分辨率圖像的技術(shù)是受激發(fā)射耗盡 (STED) 顯微鏡、基態(tài)耗盡 (GSD) 顯微鏡、單分子和基態(tài)耗盡顯微鏡，然后是單個分子返回 (GSDIM)，以及光激活定位顯微鏡 (PALM) 和隨機光學(xué)重建顯微鏡（STORM）。用于這些技術(shù)的亞分辨率顯微鏡也被稱為納米顯微鏡，因為它們在納米尺度上解析圖像。

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5.Pukinje細胞，小鼠小腦皮質(zhì)的三重標記旁矢狀切面。 紅色：anti-calbindin-D28k/Cy3，綠色：anti-GFAP/Cy5，藍色：Hoechst 33258

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